公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

描述：BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)是根 據(jù)目前世界上常用的蛋白濃度檢測方法之一－BCA （bicinchoninic acid）法改良研制而成，該試劑盒具有蛋白 濃度測定的簡單性，高穩(wěn)定性，高靈敏度和高兼容性。本試 劑盒的原理是蛋白質(zhì)分子中的肽鍵結(jié)構(gòu)在堿性環(huán)境下能與 Cu2+絡(luò)合生成絡(luò)合物，將 Cu2+還原成 Cu+，而 BCA 試劑可 敏感特異地與 Cu+結(jié)合，形成穩(wěn)定的有顏色的復(fù)合物，并在 562nm 處有最大光吸收值，該復(fù)合物顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度 成正比，可根據(jù)吸收值的大小來測定蛋白的含量，1 小時內(nèi) 即可完成蛋白定量檢測。本試劑盒含有牛血清白蛋白（BSA） 溶液作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定范圍為 25～2000 μg/ml。該 試劑盒可用于 20 次試管檢測或 200 次 ELISA 板檢測。

操作方法
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：按下表將 BSA 進(jìn)行稀釋。
管號 PBS
BSA 體積
（來源）
BSA 終濃度
（μg/ml）
A 0 300 μl (母液) 2000
B 125 μl 375 μl (母液) 1500
C 325 μl 325 μl (母液) 1000
D 175 μl 175 μl (B 管) 750
E 325 μl 325 μl (C 管) 500
F 325 μl 325 μl (E 管) 250
G 325 μl 325 μl (F 管) 125
H 400 μl 100 μl (G 管) 25
I 400 μl 0 0
2. BCA 工作液的配置：根據(jù)樣品數(shù)量及測定方法，將 BCA Reagent A 和 BCA Reagent B 按體積比 50:1充分混勻即可。
注意：配制 BCA 工作液前請將 BCA Reagent A 混勻。
3. 標(biāo)準(zhǔn)比色杯測定方法
(1)吸取 0.1 ml 的各標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品置于合適的管中。
(2)加入 2 ml BCA 工作液，充分混勻。
(3)37℃孵育 30 min，然后室溫靜置 10 min。
(4)紫外分光光度計(jì)于 562 nm 處檢測吸光度。
(5)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(6)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度。
4. 微管測定方法
(1)分別取 25 μl 新鮮配制的 BSA 標(biāo)準(zhǔn)液和待測樣品，加入到 ELISA 反應(yīng)板中。
(2)每孔加入 200 μl BCA 工作液，充分混勻。
(3)37℃孵育 30 min，然后室溫靜置 10 min。
(4)酶標(biāo)儀于 562nm 處檢測吸光度。
(5)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(6)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度。
注意事項(xiàng)
1. 待測樣品濃度在 25~2000 μg/ml 的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。
2. BCA 工作液配制后 24 小時內(nèi)使用效果穩(wěn)定。
3. BCA 法測定蛋白濃度時，吸光度會隨著時間的延長不斷加深。并且顯色反應(yīng)會因溫度升高而加快。如果濃度較低，適合在較高溫度孵育，或延長孵育時間。
4. 使用普通的分光光度計(jì)測定時，需根據(jù)比色皿的最小檢測體積，適當(dāng)加大 BCA 工作液的用量，使其不小于最小檢測體積，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的用量可相應(yīng)按比例調(diào)整。
5. 適用范圍

實(shí)例操作 按上述操作方法可得到如下標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，該線性方程經(jīng)過 多次繪制，系數(shù)均為 0.0001，且 R 2 值均在 0.99~1 之間， 重復(fù)性好，在計(jì)算蛋白濃度時可直接用該標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行 計(jì)算。例如：在 562 nm 處檢測吸光值為 0.1，則此時 y 值 為 0.1，代入方程 y=0.0001x 中，可得蛋白濃度為 1000 μg/ml。

PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備？

試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度，保證PCR反應(yīng)時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制；電泳槽：用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上，才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果。

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個循環(huán)組成，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復(fù)性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃。錯誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜ＷC整個PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復(fù)性溫度和時間:

PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間。這里需要注意，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴(kuò)增增加。

公司正在出售的產(chǎn)品：